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陽離子脂質(zhì)體的制備及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

發(fā)布時(shí)間: 2023-10-25  點(diǎn)擊次數(shù): 641次

設(shè)備及材料

  • 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

  • 陽離子脂質(zhì)

  • 氯仿

  • 蒸餾水

  • 緩沖

  • 帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的玻璃瓶

  • 玻璃注射器

  • 氮?dú)饣驓鍤?/span>

  • 真空系統(tǒng)

  • 0.22μm 過濾器(可選)

程序

  1. 將每種脂質(zhì)成分(例如,DOTAP/DOPE)溶解在氯仿中至方便的工作濃度(1-10mg/mL)。

  2. 使用玻璃注射器將所需量的每種成分等分到玻璃瓶中。有關(guān)處理脂質(zhì)有機(jī)溶液的更多信息。

  3. 全部混合玻璃瓶中的成分。

  4. 使用氮?dú)饣驓鍤饬餍⌒牡卣舭l(fā)氯仿(在充分通風(fēng)的情況下)。

  5. 將脂質(zhì)殘留物放在真空泵上 10-15 分鐘,以除去任何殘留的有機(jī)溶劑。

  6. 從真空泵中取出小瓶,并立即以最終脂質(zhì)濃度的兩倍懸浮在蒸餾水中。

  7. 將脂質(zhì)分散體超聲處理至澄清(2-5 分鐘)。

  8. 添加等體積的緩沖液(例如,308mM NaCl、40mM Hepes、pH7.4),并進(jìn)一步超聲處理 2 分鐘。

  9. 溶液可通過 0.22μm 過濾器進(jìn)行滅菌。

脂質(zhì)/DNA 混合物的制備

  1. 將陽離子脂質(zhì)分散體與 DNA(每 10μg 脂質(zhì) 1μg)混合在合適的容器中。

  2. 將脂質(zhì)/DNA 混合物孵育 5 分鐘。在室溫下。

  3. 5 分鐘后,混合物即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

  1. 用 HEPES 緩沖鹽水洗滌細(xì)胞單層兩次。

  2. 將細(xì)胞與脂質(zhì)/DNA 混合物在 HEPES 緩沖鹽水(每 100 mm 培養(yǎng)皿 3 ml 混合物)中于 37°C 孵育 90 分鐘。

  3. 孵育期結(jié)束后,根據(jù)需要更換培養(yǎng)基或補(bǔ)充。

  4. 將細(xì)胞培養(yǎng)所需的時(shí)間并收獲。

筆記

  • DOPE:陽離子脂質(zhì)的常見摩爾比為3:1和1:1。在某些情況下,全部由陽離子脂質(zhì)組成的脂質(zhì)系統(tǒng)已被用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

  • 所引用的緩沖系統(tǒng)旨在用于體外使用,并不表明該系統(tǒng)可能適合體內(nèi)使用。

參考

  • Leventis, R. 和 Silvius, JR (1990)。生物化學(xué)。生物物理學(xué)。Acta 1023:124-132。



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